病情防治

1、對于臨床血清學檢測，對于沒有標準血清的情況下，如何建立標準血清庫？（丁家波，中國獸醫藥品監察所）
　　答：當我們檢測抗體的時候，我們要知道它的抗體包括哪幾種類型，它的消長規律，我們需要模擬它。血清學檢測標準的建立需要建立在足夠量的樣品的基礎上。對于問題中提到的如何建立標準血清庫，實際上是參考血清庫的建立。因為標準血清我們是要給它賦值的，我們需要根據它來定相應的值。而參考血清對我們很重要，因為實際上試劑盒里面，我們對于特異性和敏感性是怎么來進行的，敏感性是對陽性樣本的吻合性，特異性是對陰性樣本的吻合性，所以這個時候我們要有大量的陽性樣本和陰性樣本，你的問題在進一步來說其實是問如何來確認具有代表性的陽性樣本還是陰性樣本。不同的病是不一樣的，像我們布魯氏菌病，需要多種不同的方法去篩選，去認證它，我們需要了解這個病發生的背景，布病的檢測從1897年就開始了，而后診斷方法得到不斷的改進，現如今補體結合實驗問世已經106年，它有很高的準確性和特異性，然后在這個基礎上，布病才出現了標準品。這個標準品之所以能建立，是在于我們幾乎找盡了所有能夠使用的所有方法來驗證以保證我們所選血清的代表性和真實性，不同的病只有經歷長時間的追蹤和研究，才能夠得出某種血清的符合性，然后才能被納入所謂的參考血清或標準血清。
　　2、對于指導生豬生產我們應該如何選擇不同的非洲豬瘟檢測方法，比如抗原檢測還是抗體檢測？（路易斯吉梅內斯-里羅拉，愛荷華州立大學）
　　答：選擇抗原還是抗體主要取決于兩個方面，第一個我們檢測的目的是什么？第二個疾病的發病狀態處于哪個階段？比如說，剛開始疫病暴發的時候，我們會選擇PCR進行抗原檢測，因為我們需要快速的鑒別診斷出哪些是感染動物便于剔除；第二個隨著疾病的發展，比如在非洲有多個毒株，或者歐洲的毒株還沒有被完全清除掉，有可能這個毒株會致弱，會出現無癥狀的攜帶者，包括還有一些新的毒株的引進，這個時候我們的診斷目的就變成了，要了解非洲豬瘟在整個群體里的流行率，這個時候抗體的檢測就變得更重要了。
　　3、禽弧腸病毒的基因分型情況，以及目前流行的基因型是什么？（侯麗塞勒，佐治亞大學）
　　答：很遺憾，現在沒有一個全球的廣泛分布的單個基因型存在；在已經發現的7個基因型中，在2012-2014年，基因5型占有優勢，近兩年，基因4型和基因2型有增加趨勢，其中基因4型跟臨床病例是比較密切的，基因型與臨床沒有明顯的對應關系，即不是說檢出某一個基因型就一定表現某種臨床癥狀。
　　4、非洲豬瘟造成的流產，流產胎兒是否有典型的病理組織學病變？（理查德弗蘭奇，國際動物衛生合作伙伴）
　　答：目前非洲豬瘟主要是急性和超急性的案例，可以引起母豬一些急性的臨床病變。如果我們可以在胎兒的血液或者體液中檢測到病毒的DNA，但是在胎兒中通常還不會看到病變，所以當我們看到流產的胎兒我們首先要考慮的應該是其他疾病而不是非洲豬瘟所導致的流產。
　　5、非洲豬瘟病毒在MA-104細胞中連續傳代過程中病毒會不會致弱？如果存在致弱的情況，大約最多可以擴增多少代？（道格格拉杜，美國農業部梅花島實驗室）
　　答：答案是否定的，這個細胞系僅僅在診斷病毒上有它的價值。
　　6、MA-104細胞作為一種候選細胞系，會不會隨著細胞傳代增加導致病毒不能夠很好的增殖？（道格格拉杜，美國農業部梅花島實驗室）
　　答：它能支持病毒的生長，隨著傳代會發生丟失這個缺陷，所以不能用于傳代致弱或者疫苗研發。如果作為檢測目的使用，MA-104細胞系與IPAM細胞系的表現是差不多的，僅僅是滴度低一些。

　　7、請問PEDV分離培養主要選擇什么細胞呢？減毒培養需要注意什么？怎么保證PEDV可以一直傳代培養而且在臨床毒力不返強？（王秋紅，俄亥俄州立大學）
　　答：從全球發表的文章來看，主要還是選擇Vero細胞，但是Vero細胞有不同的種類，所以我個人建議可以對不同來源的Vero細胞進行嘗試，從而選擇滴度最高的那一類別使用。持續傳代時要用盡可能低的MOI進行傳代，而且每過10代或者20代，最好要對病毒進行測序，來看看病毒有什么變化。
　　8、是否能將弱毒苗用在斷奶仔豬或者較大日齡的仔豬上進行緊急發病后豬的控制，對弱毒苗的接種方式和劑量是否有一定的建議（王秋紅，俄亥俄州立大學）
　　答：對于自然感染而存活下來的仔豬，其本身已經對該病具有了很好的免疫力。
　　9、目前高通量在獸醫領域應用越來越多，但是存在速度慢，成本高的問題，除了新病原的挖掘，請問該技術如何更好為豬場臨床提供服務？（王樂義，伊利諾伊大學）
　　答：目前對于高通量測序，對于DNA測序，在各項文庫順利建好的前提下已經可以做到在24小時內獲得初步結果，而對于RNA測序，由于隨機擴增等程序可能速度會稍慢一些。
　　10、在您實驗室的大量檢測中，您樣品分子檢測會做重復嗎？對于臨界值樣品的判定是如何把握，如果復檢是重新提取核酸還是用前一次提取的核酸樣品？如何增強對可疑樣本的判定準確性，進行三次檢測夠嗎？（張建強，愛荷華州立大學）
　　答：對于重復檢測要依據樣品的不同類別分以下幾種情況。如果是復檢血清、口腔液等樣品，需要做重復核酸提取。如果是復檢肺組織等樣品，可以選擇重新處理樣品、或者選擇使用前面保留的處理好的組織液繼續提取核酸、亦或直接使用前面提取好的核酸樣品檢測即可。
　　11、豬的輪狀病毒非常多樣，目前生豬產業中腹瀉病中PED的影響非常大，豬輪狀病毒檢出率相對較少，請問其臨床重要性如何？除此外當前對生豬產業影響最大的是哪一組的輪狀病毒，該如何進行檢測？（白建法，堪薩斯州立大學）
　　答：輪狀病毒大家都知道，可以造成腹瀉。傳統上講，A組的輪狀病毒占主導地位，在80年代末90年代初，B組和C組的影響逐漸變大。近年來C組和A組趨勢加強，在一些腹瀉的病料中經?？梢詸z測到。對于C組可能由于目前還沒有很多的序列作為探針進行檢測，所以檢出率較少。
　　12、養豬場如何能建立符合標準的檢測實驗室，需要注意哪些事項。（王君瑋，中國動物衛生與流行病學中心）
　　答：對于豬場實驗室的建設，首先需要依據豬場的規模及疫病健康管理需要來設計實驗室需要開展哪些的工作；其次，豬場實驗室如果涉及到病原學檢測還要考慮實驗室的級別，最低要達到P2級別，而在實驗室級別建設方面，要對應著相應的實驗室級別配備相應的設備和硬件建設。實驗室建設方面還會涉及到認證工作。我們國家目前對于二級實驗室還沒有強制性的認證，但是下一步，有很多的工作會要求達到一定的水平后才會準入。
　　13、田老師，您好，非瘟檢測診斷將從分子診斷過渡到分子檢測和抗體檢測并行的情況，請問臨床中如何結合使用好兩種檢測方法，特別是抗體試劑盒如何選擇，是使用阻斷法還是競爭法更好。（田克恭，國家獸用藥品工程技術研究中心）
　　答：非洲豬瘟從2018年8月以來，經歷一個由暴發流行階段到目前的常態化流行階段。在一開始，暴發階段僅僅只是野毒流行感染，這個時候通常采用核酸檢測就足夠了，現在對于豬群除了野毒，還需要關注缺失疫苗毒株，而這種現狀無疑增加了非瘟拔牙及防控的難度。在這個過程中，核酸診斷還是需要的，在這一基礎上，我們還需要區分不同類型毒株，任何一個傳染病，包括新冠，在它流行暴發初期，通過分子診斷通過核酸檢測，即病原檢測就可以，但是流行到一定階段都是需要進行抗體檢測。隨著弱毒疫苗在臨床上被運用后，非洲豬瘟通檢抗體的方法就需要被建立和運用，我們需要針對于MGF、CD2V等的抗體檢測方法，針對MGF的抗體檢測目前我和我的實驗室還沒有建立出很好的方法，而針對CD2V，我們目前已經通過不同的截短表達的策略，通過不同的表達系統和不同的標簽加入和不同的純化策略，拿到了一個比較好的抗體檢測方法。除此外，臨床上近來又面臨著新的問題，及即一些不同成分的亞單位疫苗被臨床應用，這個時候就需要建立一些不同于一些常規組分（例如：P30、P54、P72、CD2V、MGF等）的抗體檢測方法，否則將難以區分野毒還是疫苗毒。我手上有92個針對非洲豬瘟不同的蛋白，其中有10多個已經在有資質的實驗內評價過。至于用間接法還是競爭法哪種方法更好，我覺得競爭法有競爭法的好處，間接法如果做到極致，也是可以的。如果間接法做不到極致，那么做競爭法就需要做到極致，這個方法上都各有所長，但是都需要盡最大努力做到極致，而非洲豬瘟的檢測方法有沒有做到極致，在臨床上是最能夠得到直接的驗證。
　　14、分子檢測：對于目前新的基于CRISPR-Cas核酸檢測技術未來發展怎么樣？等溫擴增時間快，靈敏度高，為什么這么多年一直沒有發展起來？ （原霖，中國動物疫病預防控制中心）
　　答：對于CRISPR-Cas技術在診斷方面的進展我們一直在關注。今年由于新冠的促進，人醫方面已經有相關的診斷產品問世，但是在獸醫方面還沒有相關的產品。對于這種新技術在診斷方面的發展，我們還要從以下兩個方面去關注，首先我們要看是否有公司去推出相關的產品，我們需要通過一些評價指標：敏感性、特異性、臨床敏感性、臨床特異性、重復性等等，來綜合判斷這個技術性產品的性能究竟如何，其次還要考慮成本的問題。對于第二個有關等溫擴增技術為什么這么多年沒發展起來的問題，我認為這項技術由于非洲豬瘟的發生和促進，已經取得了很大的進展，在非洲豬瘟沒出現之前才算沒有發展。當然每種方法都有它的有點和缺點，問題中所談到的沒有發展起來應該指的是與熒光定量的方法去比，因為對于熒光定量的方法在成本控制和技術成熟度上，目前還沒有哪種方法可以與之媲美或者超越它。而對于等溫擴增（LAMP），也有它的優勢存在，例如它的設備簡單、檢測時長短，現在很多方面也得到了應用，但是與熒光定量相比在成本和敏感性方面還是存在差異。所以說每種檢測方法都有各自的優勢，在選擇方面需要針對自己的實際需求來選擇。
　　15、診斷試劑臨床實驗由研發單位開展是否可行？國家政策依據。（夏應菊，中國獸醫藥品監察所）
　　答：針對診斷試劑臨床試驗方面我們對于臨床樣品的數量有要求，對于臨床試驗中需要涉及多少家單位是沒有要求的。對于研發單位通常是不能作為臨床試驗單位的。
　　16、診斷制品開展臨床實驗暫時沒有GCP的要求吧？是否有國家政策文件支持。（夏應菊，中國獸醫藥品監察所）
　　答：我們要求需要開展臨床試驗的單位必須跟有開展臨床試驗資質的單位先簽訂協議，對于臨床試驗資質方面，不一定需要GCP，只要能夠滿足能提供足夠數量的臨床樣品即可開展。
　　17、對于疾病的診斷，是不是有了分子生物學診斷方法以后，對于臨床診斷和病理診斷這些環節就可以跳過？（莫妮克弗朗卡，佐治亞大學）
　　答：疾病的診斷是一個系統的過程，沒有一種方法是確診的，在疾病診斷的過程中應該全面而系統的運用多種檢測方法才能得出相對精準的診斷結果。
　　18、針對目前貓、狗、水貂等均可以感染新冠，而這些動物與我們人類的生活密切相關，為此在動物領域開發新冠疫苗有必要嗎？（琳達塞夫院士，俄亥俄州立大學）
　　答：是否有必要做，取決于兩個方面，第一方面看動物感染的數量、程度、范圍，這些內容需要更多的數據和證據來證明開發動物用新冠疫苗的重要性；第二方面現在已經有2例新冠可以從感染的水貂感染人類的案例出現，這提醒我們需要有更多的數據來監測新冠從宿主再傳回人類的可能性，所以現在談論這個問題還為時過早。